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http://www.abbs.info e-mail:[email protected] ISSN
0582-9879
ACTA BIOCHIMICA et
BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(9): 864–872
CN 31-1300/Q |
Baculovirus p74 Gene is a Species-specific
Gene
WU Wu-Wei, WANG
Jing-Wen, XIE Fei, LONG Qing-Xin, WANG
Xun-Zhang*
( State Key Laboratory for Biocontrol, Zhongshan
University, Guangzhou 510275, China )
Abstract The
p74 gene of Autographa californica multicasid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)
bacmid was knockouted and substituted by the p74 gene of Spodoptera
litura multicapsid nucleopolyhedrovirus (SpltMNPV), using RecA-mediated
homologous recombination in the E. coli. No selection marker, which
might influence the expression and function of p74 gene, was left in the
modified p74 locus. The promoter of AcMNPV p74 gene directly controlled
the expression of SpltMNPV p74 gene in the recombinant AcMNPV
bacmid-polhSL74. RT-PCR showed that the substituted p74 gene was
transcribed. Bioassay showed that the recombinant virus AcMNPV bacmid-polhSL74
could not infect the Argyrogramma agnata larvae per os, and thus showing
the p74 gene is species-specific.
Key words baculovirus； p74 gene； RecA-mediated homologous
recombination； species specificity
杆状病毒p74基因具有种属特异性
吴无畏 王瑾雯 谢菲 龙綮新 王珣章*
（ 中山大学生物防治国家重点实验室， 广州 510275 ）
摘要 摘要选用苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒杆粒(AcMNPV bacmid)为材料， 通过在大肠杆菌中利用RecA基因介导的同源重组， 将其p74基因剔除， 并精确地用斜纹夜蛾核多角体病毒（SpltMNPV）的p74基因进行了替换。 所构建的重组AcMNPV杆粒在修饰后的p74基因位点中未留下任何有可能影响该基因表达及功能的选择标记，
SpltMNPV的p74基因直接位于AcMNPV p74基因的启动子控制下。 RT-PCR显示替换后的p74基因得到了表达。 生物测定结果显示， 重组病毒AcMNPV 杆粒-polhSL74无法通过口服方式感染银纹夜蛾幼虫， 表明杆状病毒p74基因具有种属特异性。
关键词 杆状病毒； p74基因； RecA介导的同源重组； 种属特异性
昆虫杆状病毒是一类闭合环状双链DNA病毒， 其长度在80～180 kb之间。 作为一种生物杀虫剂， 它在害虫的生物防治中有重要作用， 而作为一种重要的真核蛋白质表达系统， 它也得到了广泛的应用［1］。 杆状病毒在其生活史中存在两种病毒粒子：芽生型病毒粒子（budded virus， BV）和包埋型病毒粒子（occlusion derived virus, ODV）。 其中， BV主要在宿主体内细胞间进行传播， 而ODV则主要在虫体之间传播。 在自然条件下， 杆状病毒感染宿主过程为： 包含病毒ODV粒子的多角体经昆虫幼虫口服并在幼虫中肠碱性环境裂解释放出ODV粒子， ODV粒子穿过围食膜， 通过病毒囊膜与中肠细胞膜融合将病毒核衣壳释放到细胞质中， 完成对昆虫细胞的感染。 这一过程中， ODV囊膜与中肠细胞膜融合的一步是非常关键的［2］。
ODV囊膜上有多种蛋白质， 包括p25、ODV-E66、ODV-E56、ODV-E18、ODV-E35、gp41和p74等［3］。 研究表明， p74基因缺失的病毒保留了BV的感染力， 却丧失了ODV的感染力， 即p74基因缺失病毒对昆虫幼虫没有口服感染能力， 这表明p74基因是一个杆状病毒口服感染力相关的基因［4,5］。
苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒杆粒（AcMNPV bacmid）是一种人工构建的既可在大肠杆菌中复制，
又可在昆虫细胞中复制并形成杆状病毒的DNA分子［6］。
其拥有大肠杆菌F因子的复制子mini-F的特点， 与广泛使用的细菌人工染色体（BAC）十分相似［7］。 20世纪90年代末， 人们发明了多种针对BAC的基因修饰方法， 有学者将应用这些方法进行BAC改造统称为重组工程（recombineering）［8］。
本文采用AcMNPV杆粒代替野生型AcMNPV 病毒， 应用重组工程中的一种方法——RecA基因介导的同源重组［9,10］， 构建了p74基因替换的重组AcMNPV 杆粒， 以对p74基因的种属特异性进行研究。
1 材料和方法（Materials and Methods）
1．1 材料
AcMNPV杆粒及pFastBac1 质粒来自Invitrogen公司的Bac-to-Bac系统， 质粒pDF25和pKOV-Kan由英国Birmingham大学 Lalioti博士惠赠［10］， pDF25中包含大肠杆菌的RecA基因, 它的表达产物用于在宿主菌中介导同源重组， pKOV-Kan中包含负选择标记SacB基因， 它的表达产物可在蔗糖培养基中阻碍宿主菌的生长。 野生型AcMNPV、野生型斜纹夜蛾核多角体病毒（SpltMNPV） G-2株、粉纹夜蛾细胞系Tn-5B1-4（Hi5）、大肠杆菌DH10B由本室保存。 Taq酶和Pfu酶购自上海生工生物工程公司。 T4 DNA连接酶、限制性内切酶、核酸分子量标准购自大连宝生物工程公司。 TriPure Isolation Reagent、AMV反转录酶购自Boehringer Mannheim公司。 RQ1无RNA酶的DNA酶购自Promega公司。 DNA凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司。 质粒提取试剂盒购自上海博彩生物工程公司。 引物合成和DNA测序由上海博亚生物工程公司完成。 其他试剂为国产分析纯。
Fig.1 The primers’ position and the plasmids’ structure
（A） The position of the PCR primers
within the p74 gene of the AcMNPV and SpltMNPV. （B） The
flowchart of constructing plasmid pKOV-A74O and pKOV-S74I.
1．2 方法
1．2．1 构建含多角体基因的AcMNPV杆粒-polh 根据AcMNPV的多角体基因序列， 设计了一对引物polh1： 5′-GGAATTCTGGAAATGTCTATC-3′ 和polh2： 5′-GCTCTAGAACAATGTATCGTG-3′， 将野生型AcMNPV的多角体基因及启动子用Pfu酶扩增出， 用EcoRI 酶切后， 与用EcoRI和SnaBI双酶切的pFastBac1连接， 获得转移载体质粒pFastBacPolh， 再按Invitrogen公司的Bac-to-Bac杆状病毒重组表达系统手册中的方法， 将多角体基因重新导回商品化的AcMNPV杆粒， 提取杆粒DNA并转染粉纹夜蛾细胞系Tn-5B1-4， 获得有多角体表型的杆状病毒。 收获转染后得到的杆状病毒多角体， 提取病毒DNA， 再将病毒DNA电激转化大肠杆菌DH10B， 获得仅含AcMNPV 杆粒-polh的大肠杆菌DH10B。
1．2．2 p74基因缺失和基因插入质粒的构建(图1) 根据AcMNPV的基因组中p74基因上下游序列， 设计2对引物， p74基因下游：ACP74L1：5′-AGGCGGCCGCGACCTTTAATTCAACCC-3′， ACP74L2：5′-CGAGCTCTGGCGTTTACAGCATTTGTT-3′； p74基因上游： ACP74R1：5′-GTTATATAGGACTTAAAATAAAC-3′， ACP74R2：5′-TCGGATCCAGGGAAACATACAC-3′。 将野生型AcMNPV p74基因上游和下游序列用Pfu酶各扩增约550 bp， 将它们按在AcMNPV基因组中的顺序连入经酶切的pKOV-Kan， 得到用于做p74基因剔除的质粒pKOV-A74O。 再根据SpltMNPV p74基因序列， 设计1对引物， SLP741：5′-CAGAGCTCGATTGTCCGGGTGGCG-3′， SLP742：5′-ATGAGCGCGCACGTAAATTCTCCGA-3′。 用Pfu酶扩增出SpltMNPV p74基因， 连入pKOV-A74O质粒中， 得到SpltMNPV p74基因紧连着AcMNPV p74基因上游序列的质粒pKOV-S74I， 用于做SpltMNPV p74基因的插入。 质粒插入片段均经测序证明序列正确。 PCR引物位置及质粒构建过程见图1。
1．2．3 AcMNPV 杆粒-polh p74基因的剔除(图2) 将质粒pKOV-A74O（含chlR氯霉素抗性基因）和pDF25（含tetR四环素抗性基因）用CaCl2法转化仅含AcMNPV 杆粒-polh(含kanR卡那霉素抗性基因)的大肠杆菌DH10B， 并用含3种抗生素 (氯霉素、四环素和卡那霉素)的LB平板于30 ℃筛选。 选取数个单克隆再次涂布于氯霉素和卡那霉素双抗性LB平板上, 43 ℃培养后, 由于质粒pKOV-A74O和pDF25是温度敏感型的， 不能在43 ℃培养环境中复制， 只有那些发生同源重组将pKOV-A74O共整合到AcMNPV 杆粒-polh上p74基因处的克隆才能在氯霉素和卡那霉素双抗中生存， 未发生重组的克隆会因在复制中失去pKOV-A74O和pDF25而不能抵抗选择压力。
Fig.2
Knockout the p74 gene of AcMNPV bacmid-polh
将氯霉素和卡那霉素双抗性LB平板上的阳性克隆再转入pDF25以便发生第二次同源重组。 将转化出的克隆在含卡那霉素和70 g/L蔗糖的LB平板上于 43 ℃培养， 发生二次同源重组后pKOV-A74O质粒从共整合体中分离出， 并在复制过程中丢失， 而未发生二次同源重组的大肠杆菌由于含pKOV-A74O质粒中的SacB基因而不能在蔗糖培养基中生长， 因此， 转化出的克隆都将是发生了二次同源重组的大肠杆菌。 如果第二次重组利用的同源片段部位与第一次相同, 则得到未被修饰的AcMNPV 杆粒-polh， 而如果与第一次重组不同, 则得到p74基因剔除的AcMNPV 杆粒-polh△p74。
先用氯霉素抗性LB液体培养基确认转化出的克隆失去了pKOV-A74O质粒， 再用引物ACP74L1与 AC P74R2进行PCR来鉴定重组子， 其中扩增出1.1 kb片段（包含p74基因上游和下游序列各约550 bp）的为剔除了p74基因的AcMNPV 杆粒-polh△p74， 扩增出2.9 kb（包含p74基因上游和下游序列各约550 bp及1.8 kb的p74基因）片段的为原始AcMNPV 杆粒-polh。 p74基因剔除过程见图2。
1．2．4 AcMNPV 杆粒-polh p74基因的替换 采用与1．2．3 同样的方法， 换用pKOV-S74I质粒， 完成了SpltMNPV 的p74基因对AcMNPV 杆粒-polh中的p74基因的替换， 并设计2对引物进行PCR以鉴定完成了p74基因替换的重组病毒AcMNPV 杆粒-polhSL74 ［引物位置见图1（A）］。 AT1：5′-AAACCAAATCTGCCAGCGTCAAT-3′， AT2：5′-GTCGTGGCGGTAGTATGCTGGAA-3′ （可特异扩增AcMNPV p74基因中一个623 bp片段）； ST1：5′-CTGAATTGCCATCCGAGTCAGTG-3′， ST2： 5′-TGCGTAGGTACGGGGAATTTAGA-3′ （可特异扩增SpltMNPV p74基因中一个859 bp片段）。
1．2．5 AcMNPV 杆粒-polhSL74中p74基因表达的RT-PCR 鉴定 用AcMNPV 杆粒-polhSL74 DNA转染粉纹夜蛾细胞系Tn-5B1-4， 收获重组病毒BV粒子， 再感染Tn-5B1-4细胞（感染复数MOI=5）， 20 h后收集感染的细胞， 按Boehringer Mannheim公司手册中的方法用TriPure Isolation Reagent提取细胞总RNA， 提取的RNA再以无RNA酶的DNA酶的DNA酶37 ℃处理5 min， 80 ℃10 min灭活DNA酶， 取2 μl 为模版用寡聚dT为引物反转录成cDNA， 再取1 μl cDNA 以ST1和ST2引物进行PCR反应。
1．2．6 AcMNPV 杆粒-polhSL74生物活性的测定 将AcMNPV 杆粒-polh， AcMNPV 杆粒-polh△p74和AcMNPV 杆粒-polhSL74三个重组病毒按感染复数MOI=5感染Tn-5B1-4细胞。 72 h后收集感染细胞中的病毒多角体。 以pH 7.0的磷酸缓冲液（PBS）将每种病毒多角体（polyhedro inclusion body， PIB）分别稀释到5 PIBs/μl、15 PIBs/μl和50 PIBs/μl三种浓度， AcMNPV 杆粒-polhSL74另多稀释一种浓度， 到500 PIBs/μl。 每种病毒每个浓度分别取3 μl涂于饲料上喂食一头三龄银纹夜蛾幼虫， 每种病毒每个浓度喂30头幼虫,对照也取30头幼虫但仅喂食不含病毒多角体的饲料。 将幼虫置于养虫杯内， 于27 ℃的生化培养箱内单头培养，
10日后计算死于多角体感染的幼虫数， 用SPSS软件中PROBIT分析工具计算每种病毒的半致死剂量（LD50）及95%置信区间。
2 结果（Results）
2．1 AcMNPV
杆粒-polh的构建
提取AcMNPV 杆粒-polh DNA并转染粉纹夜蛾细胞系Tn-5B1-4后， 获得有多角体表型的杆状病毒（图3）， 表明AcMNPV 杆粒-polh构建成功。
Fig.3 Tn-5B1-4
cell transfected by AcMNPV bacmid-polh DNA
2．2 p74基因缺失和基因插入质粒的构建
质粒pKOV-A74O以引物ACP74L1和ACP74R2进行PCR， 获得一条约1.1 kb的片段， 包含AcMNPV p74基因上游和下游序列各约550 bp（结果未显示）， 表明质粒pKOV-A74O构建成功。 以质粒pKOV-A74O为基础构建的质粒pKOV-S74I经DNA测序表明， 克隆到质粒pKOV-S74I中的SpltMNPV p74基因序列与GenBank上发表的序列一致， 且其位于AcMNPV p74基因上游和下游序列中间， 表明质粒pKOV-S74I构建成功。 图4为部分测序结果， 显示SpltMNPV p74基因的起始密码子ATG紧跟着AcMNPV p74基因上游序列。
Fig.4
Partial sequence
of plasmid pKOV-S74I
2．3 AcMNPV
杆粒-polh p74基因的剔除
AcMNPV 杆粒-polh△p74用引物ACP74L1与 ACP74R2进行PCR鉴定， 扩增出约1.1 kb片段； 以引物AT1与 AT2进行PCR不能扩增出产物， 表明AcMNPV 杆粒-polh中p74基因已经剔除， AcMNPV 杆粒-polh△p74构建成功［图5（A）］。
Fig.5
PCR
identification of recombinant AcMNPV bacmid
(A) PCR identification of AcMNPV bacmid-polh△p74. M, marker; 1, with primer ACP74L1 and ACP74R2; 2, with primer AT1 and AT2. (B) PCR identification of AcMNPV bacmid-polhSL74. M, marker; 1, with primer ST1 and ST2; 2, with primer AT1 and AT2.
2．4 AcMNPV 杆粒-polh p74基因的替换
AcMNPV 杆粒-polhSL74用ST1和ST2为引物进行PCR可扩增出859 bp片段， 用AT1和AT2为引物不能扩增出产物， 表明AcMNPV 杆粒-polh p74基因已经被SpltMNPV 的p74基因替换， AcMNPV 杆粒-polhSL74构建成功［图5（B）］。
2．5 AcMNPV 杆粒-polhSL74中p74基因表达的RT-PCR鉴定
AcMNPV 杆粒-polhSL74感染粉纹夜蛾细胞系Tn-5B1-4 20 h后， 提取细胞总RNA， 经无RNA酶的DNA酶处理去除可能的基因组DNA污染， 用寡聚dT为引物将其反转录为cDNA， 再以ST1和ST2为引物进行RT-PCR， 可特异扩增出859 bp片段， 表明AcMNPV 杆粒-polhSL74中SpltMNPV p74基因获得了转录（图6）。
Fig.6
RT-PCR identification of the expression of SpltMNPV p74 gene in the Tn-5B1-4
cell infectd by AcMNPV bacmid-polhSL74
M,
marker; 1, with cDNA template; 2, with RNA template.
2．6 AcMNPV 杆粒-polhSL74的生物活性测定
测定结果见表1。
Table 1 ODV infectivity of 3 recombinant AcMNPV
bacmids in vivo by per os feeding the Argyrogramma agnata larvae*
|
Virus |
Mortality at each dosage # |
LD50 (95% c.i.) |
|||
|
1500 PIBs |
150 PIBs |
45 PIBs |
15 PIBs |
||
|
AcMNPV bacmid-polh |
NA |
24/25 |
12/27 |
5/29 |
41(30－57) |
|
AcMNPV bacmid-polh△p74 |
NA |
0/26 |
0/27 |
0/27 |
0 |
|
AcMNPV bacmid-polhSL74 |
0/25 |
0/27 |
0/28 |
0/26 |
0 |
|
Control |
0/30 |
0 |
|||
* 30 three-instar Argyrogramma agnata larvae per dose were fed the indicated numbers of OB on a small diet sample. # Insects were scored for mortality at 10 days post infection and the number of dead insects over the number of insects infected is given for each dosage. NA， no available.
3 讨论（Discussion）
p74基因编码杆状病毒ODV囊膜上的一个重要蛋白质， 它在杆状病毒入侵昆虫的过程中起了关键作用， p74基因缺失的病毒无法通过口服方式感染昆虫幼虫， 这表明p74基因产物很可能参与了ODV粒子对昆虫中肠细胞的吸附和融合［4,5］。 但是， p74基因是否与杆状病毒寄主范围决定有关， 是否具有种属特异性尚无报道。 为此， 本文拟构建一个含异源p74基因的重组AcMNPV， 通过观察该病毒是否可以通过口服方式感染其敏感昆虫银纹夜蛾幼虫， 以确定p74基因是否具有种属特异性。
1993年， Luckow等［3］首先在苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒中引入大肠杆菌F复制子， 获得了既能在大肠杆菌中复制， 又能在昆虫细胞中复制的重组杆状病毒—AcMNPV 杆粒（bacmid）［6］。 为快速得到重组杆状病毒， 本文选择了AcMNPV杆粒代替野生型AcMNPV 病毒， 这是由于AcMNPV杆粒的结构与近年广泛使用的细菌人工染色体（BAC）十分相似。 BAC载体能克隆大至300 kb的DNA片段［7］。 为了修饰BAC中克隆的这些大片段DNA， 人们发明了多种称为重组工程［8］ 的方法， 其中包括了RecA基因介导的同源重组［9,10］、RecE和RecT基因介导的ET重组［11］、缺陷型原噬菌体介导的Red 重组［12］、单链DNA介导的同源重组［13］等。
由于AcMNPV杆粒与BAC都是基于大肠杆菌F复制子而构建的， 重组工程的方法因而也可用于AcMNPV杆粒基因的修饰。 2000年， Bideshi等［14］首次利用在大肠杆菌BJ5183中同源重组的方法， 缺失掉AcMNPV杆粒的解旋酶基因， 并将粉纹夜蛾颗粒体病毒的解旋酶基因插入到AcMNPV杆粒的多角体基因处进行表达， 以研究解旋酶基因的种属特异性。 随后， 陆续开始有科学家用重组工程的方法来修饰杆状病毒杆粒的基因［15～17］。 而本文则采用了RecA基因介导的同源重组这种方法。
由于AcMNPV杆粒是多角体缺陷型的［6］， 无法经过口服途径感染银纹夜蛾幼虫， 而本文欲研究的p74基因与杆状病毒口服感染力有关［4,5］， 为此首先构建了含多角体基因的AcMNPV 杆粒-polh， 并以此作为野生型AcMNPV对照。
本文获得的完成了p74基因原位替换的重组杆状病毒AcMNPV 杆粒-polhSL74中， 替换以后的SpltMNPV p74基因起始密码子ATG紧跟AcMNPV p74基因上游序列， 这样SpltMNPV p74基因的表达将与原来的AcMNPV p74基因受到一样的调控， RT-PCR结果也证实了这一点。 因此， 理论上该病毒除了p74基因外， 其他基因的表达都与野生型病毒一样。 所以， 通过观察该病毒对AcMNPV敏感昆虫银纹夜蛾幼虫的口服感染力， 即可确定p74基因是否具有种属特异性。
生物测定结果显示， AcMNPV 杆粒-polh可以通过口服方式感染银纹夜蛾幼虫， 而p74基因剔除的AcMNPV 杆粒-polh△p74与文献报道的结果一样， 无口服感染力［5］， 这表明用AcMNPV杆粒代替野生型AcMNPV是可行的。 而AcMNPV 杆粒-polhSL74也无口服感染力的结果表明， SpltMNPV p74基因无法代替AcMNPV p74基因的功能， 也就是说， p74基因具有种属特异性。 此外， 我们同样通过RecA基因介导的同源重组方法， 将AcMNPV p74基因再替换掉AcMNPV 杆粒-polhSL74中SpltMNPV p74基因， 所得的病毒恢复了对银纹夜蛾幼虫的口服感染力（结果未显示）， 说明AcMNPV 杆粒-polhSL74口服感染力的丧失与病毒其他基因无关。
SpltMNPV p74基因与AcMNPV p74基因产物的氨基酸序列同源性达到53%， 这是SpltMNPV基因与AcMNPV同源基因中同源性最高的几个之一［18］。 然而， 虽然AcMNPV是已知杆状病毒中杀虫谱最广的， 它对斜纹夜蛾这种严重危害东南亚地区农作物的害虫却无效， 研究表明AcMNPV无论是通过口服还是注射均无法杀死斜纹夜蛾， 而注射AcMNPV BV粒子可引起斜纹夜蛾细胞发生凋亡， 说明细胞凋亡基因是一个宿主范围决定因子［19］。 本研究则显示， 在自然界中杆状病毒通过口服方式在昆虫虫体之间传播时， p74基因也是一个宿主范围决定因子。
Slack等［20］用网上蛋白质跨膜结构域分析预测软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）分析了AcMNPV p74基因， 结果显示P74蛋白是一个跨膜蛋白质， 3个跨膜区把P74蛋白分为了膜内和膜外两大部分， 而他们的实验也证明， 占P74蛋白总长约10%的C末端第2和第3跨膜结构域介导了P74蛋白向被感染细胞核内的运输。 我们用该软件分析了SpltMNPV p74基因产物的蛋白质跨膜结构域， 发现其预测结果与AcMNPV p74基因十分相似， 同样是由3个跨膜区把P74蛋白分为膜内和膜外两个部分。 因此， 下一步准备再构建几个进行p74基因部分替换的重组病毒， 以确定p74基因种属特异性发生于哪段区域。
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Received: April 14, 2003 Accepted： June 6, 2003
This work was supported by a grant from the National Natural Science Fundation of China (No.30170039)
*Corresponding author： Tel, 86-20-84112504; Fax, 86-20-84113964; e-mail, [email protected]